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微藻

  无论是从生态学还是从植物系统学的研究来看,微藻都是我们这个地球上最基本最重要生产者,没有了它们其它形式的生命的生存便会受到致命的威胁。

  微藻为其它生命提供了营养源,它们本身是具有营养价值的。对于我们人类而,能否从它们那里直接或间接地获得我们所需要的营养便是我们对微藻进行研究的首要任务。

  微藻 - 概述

  微藻是一类在陆地、海洋分布广泛,营养丰富、光合利用度高的自养植物,细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等,使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。

  微藻种类繁多,微藻细胞中含有:蛋白质、脂类、藻多糖、β-胡萝卜素、多种无机元素(如Cu,Fe,Se,Mn,Zn等)等高价值的营养成分和化工原料。微藻的蛋白质含量很高,是单细胞蛋白(SCP)的一个重要来源。微藻所含的维生素A、维生素E、硫氨素、核黄素、吡多醇、维生素B12、维生素C、生物素、肌醇、叶酸、泛酸钙和烟酸等增加了其作为SCP的价值。

  藻中类胡萝卜素含量较高,具有着色和营养的作用,可用来防治癌症、抗辐射、延缓衰老,增强机体免疫力等生理作用。化学合成均为反式的β-胡萝卜素,对人体有致癌、致畸的作用,而顺式异构体在抗癌、抗心血管疾病功能比全反式异构体高,藻粉中β-胡萝卜素含量高达14%。藻细胞中甘油含量较高,是优质的化妆品原料,也是化工、轻工和医药工业中用途极广的有机中间体。藻多糖复合物可作为免疫佐剂增强抗原性和机体免疫功能,明显抑制实体瘤S180起到抗肿瘤的作用。

  微藻是最简单、最古老的低等植物之一,不仅种类多、分布广、繁殖快,而且光合作用效率高,它可直接利用阳光、二氧化碳、氮、磷等简单营养物质快速生长并在胞内合成大量油脂(如甘油三酯),为生物柴油生产提供新的油脂资源;同时在污水中生产的微藻还可以降低污染、净化水质。

  2011年2月19日,973计划重大项目“微藻能源规模化制备的科学基础”在浙江省嘉兴市正式启动。项目围绕从藻种选育到微藻能源规模化制备中生物学及工程学方面的3个科学问题开展研究,如能源微藻胞内代谢及油脂合成与积累的系统生物学机制、能源微藻规模化培养的物质和能量转化及环境调控规律和微藻能源规模化加工等,目的是以能源微藻大规模培养为背景,提高微藻能源规模化制备系统的效率。

  项目将从胞内代谢认知、规模培养、能源产品加工与系统集成优化层面开展研究,包括藻种选育及细胞本身基础代谢规律与调控机制发现,从规模培养角度,研究微藻细胞对环境响应与调控机制、光生物反应器原理和规律、微藻光自养培养工艺优化和从藻细胞采收、油脂提取、生物柴油制备等。 [1]

  微藻 - 培养方式

  (一) 纯培养与单种培养

  纯培养与单种培养是按培养的纯度来划分的。

  纯培养:是指排除了细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养要求有无菌室、超净工作台等设备条件,容器、工具、培养液等必须严格灭菌。纯培养是科研工作中不可缺少的技术。

  单种培养:生产性的培养中,是不排除细菌存在的,为了区别于纯培养而称之为单种培养。

  (二)一次培养、连续培养和半连续培养

  该类培养是按采收方式划分的。

  一次培养:又称有限培养,是在一定的容器中,根据藻类需要加入无机和有机营养,配成培养液,把少量的藻种接种进去,然后在适宜于藻类生长的环境条件(温度、盐度、光照、PH值等)下培养,待藻液达到一定的密度后,便一次性采收或作进一步扩大培养。

  连续培养:一般在室内进行,采用自动控温、人工光源、封闭式通气培养。在培养容器内,新的培养液不断流入,达到一定密度的培养液不断流出。培养液的流入量和流出量可根据微藻的生长情况及需要进行人不控制,并保持平衡。在培养过程中,营养物质浓度和藻类细胞相对稳定,产量高,在国外应用较多,中国目前生产上很少采用。

  半连续培养:是指在一次培养的基础上,当藻类细胞达到一定密度后,每天收获一部分浓藻液,并加入新的营养液继续培养。半连续培养是生产中常用的方法,每天的收获量根据育苗的需要及藻液的生长情况确定。

  (三)藻种培养、中继培养和生产性培养

  该类培养是按培养的规模和目的来划分的。

  藻种培养:在室内进行,一般采用一次性培养法。培养容器为100-3000毫升的三角烧瓶,瓶口用消毒的纸或纱布包扎。目的是培养和供应藻种。

  中继培养:目的在于培养较大量的高密度纯种藻液,供应生产性培养接种使用。中继培养一般在室内用大的玻璃容器或塑料大袋中进行。根据需要可分为一级中继培养和二级中继培养。一级中继培养的容器为10升的大口玻璃缸(南方各省多用)、10-20升的细口瓶或鱼苗袋,以封闭式不通气培养为主。二级中继培养的容器为0.2-0.4立方米的水族箱、0.5-1.0立方米的玻璃钢水槽、0.5-1.0立方米的小型水泥池等,以开放式通气一次性培养为主;利用塑料大袋进行二级中继培养也是新兴的、有效的好方法 。

  生产性培养:可在室内也可在室外,有封闭式培养和开放式培养两种类型。目的是供给育苗中的饵料。培养容器为大型水泥池、大型玻璃钢水槽的塑料大袋;也有用土池培养的情况。

  (四)封闭式培养与开放式培养

  是按照藻液与外界的接触程度划分的。

  封闭式培养:是把培养液密封在透明的容器中,与外界隔离。培养容器多为管状,用有机玻璃或透明的聚乙烯塑料做成管道,水平、直立或斜立于地上,暴露在阳光中(或用日光灯光源),二氧化碳完全采用人工供给的办法,并利用水泵使培养液不断循环。完全封闭式培养所用的设备主要包括培养槽、气体交换塔和控制系统三部分,其优点是容易控制,产量稳定,但设备成本较高。 [2]

  微藻 - 培养方法

  微藻培养的一般方法为:容器、工具的洗涤和消毒,培养液的制备,接种,培养管理。

  (一)容器、工具的洗涤和消毒

  培养用容器、工具的洗涤和消毒是微藻培养中最基本的一项,稍有疏忽就会引起藻种间的混杂和敌害生物的污染,造成整个培养工作失败,因此必须引起足够的重视。

  所有培养用容器、工具都必须在用前用去污粉、洗液或肥皂粉等刷洗并冲洗干净,如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸钙等物粘附,不易刷洗,可用1%浓度左右的稀盐酸浸泡去除,然后用水冲洗。容器、工具洗刷干净后,用以下几种方法进行消毒。

  1、加热消毒法

  加热消毒法是利用高温杀死微生物的方法。不耐高温的容器、工具,如塑料和橡胶制品等不能用此法消毒。

  (1)直接灼烧消毒:接种环、镊子等金属小工具,试管口,瓶口等可以直接在酒精灯火焰上短暂灼烧消毒。载玻片、小刀等则最好先蘸酒精,然后在酒精灯火焰上点燃,等器具上的酒精烧光,也就完成了消毒操作。直接灼烧消毒可以直接把微生物烧死,灭菌彻底。优点是简单、方便、快速、效果好。但只适用于小型金属或玻璃工具。

  (2)煮沸消毒:把容器、工具放入锅中,加水煮沸消毒。一般在水中煮沸10-20分钟。对大型锥形瓶消毒时,可在锥形瓶口放一只培养皿,然后在锥形瓶中加少量淡水,加热煮沸完毕即用消毒纸或纱布蒙上备用。煮沸消毒法的作用是杀死全部营养体的部分芽孢。如果在水中加1%碳酸钠效果更好,此法只适用于小型的容器、工具。

  (3)烘箱干燥消毒

  目前国内采用的玻璃柱和塑料袋培养,效果很好。具有方法简单、成本低、培养的藻细胞密度大、不易被污染、生产周期短等优点。

  开放式培养:是把微藻培养在敞开的容器中。二氧化碳采用人工供给或依靠与空气的自然交换,如常见的广口玻璃缸、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池培养等。开放式培养设备简单,成本低,是目前培养微藻的主要形式。开放式培养由于光照充足,通风较好,藻细胞生长繁殖迅速,但因藻液与外界接触面大,容易受敌害生物污染。

  将玻璃容器、金属工具等洗涤清洁,待干燥后放入烘箱(亦称恒温干燥箱)中,关闭烘箱,打开通气孔,接通电源,加热。当温度达到120摄氏度时,关闭通气孔,停止加热,维持2小时,然后关闭电源。此时切不可打开烘箱门,必须等烘箱内温度逐渐下降到60摄氏度以下才能打开烘箱门。在消毒过程中,温度上升或下降都不能过急,否则玻璃器皿容易炸裂。

  2、化学药品消毒法

  在大规模培养微藻的生产中,大型容器、工具及培养池一般用化学药品消毒,常用的消毒药品有漂白粉(或漂白液)、酒精、高锰酸钾等。

  (1)漂白粉[Ca(ClO)2]或漂白液:漂白粉又称氯石灰,为白色粉末状物质,是氯与氢氧化钙作用的产物。在空气中因受二氧化碳作用,逐渐放出次氯酸而有强烈的刺激性气味。工业上用的漂白烩一般含有效氯为30%-35%,消毒时按万分之一到三的含量配成水溶液,把容器、工具在溶液中浸泡半小时,再用消毒水(经过煮沸或沉淀过滤的水)冲洗三四次即可。白瓷砖池、水泥池的消毒可配成高浓度浆糊状的漂白粉溶液淋洒池壁,半小时后用消毒水冲洗干净;为充分消毒培养池,也可用较低量的漂白粉进行全池浸泡后用消毒水冲洗干净。因漂白粉有氯臭味,还需要停放12小时才能接种使用(一般下午消毒池子,明天早上接种),以免抑制微藻生长。

  使用漂白粉消毒需长时间浸泡,同时氯臭味较难除去。漂白粉暴露于空气中易分解,遇水或乙醇也分解,应密封储存。也可用漂白精进行消毒,漂白精主要成分是次氯酸钙,一般含有效氯70%左右,用漂白精消毒,用量应减半。漂白液含有一定量的NaClO,是化工厂的副产物,有效氯的含量一般在5%左右。由于漂白液具有价格低廉、无大型杂质、不产生沉淀物及便于储藏和用法简单等优点,被育苗场广泛地用于容器、工具和培养池的消毒。使用时可参照漂白粉的用量进行具体的调整。

  (2)酒精(C2H5OH) :酒精即乙醇。酒精能使生物蛋白质脱水变性凝固,故有杀菌作用。70%酒精杀菌能力最强,常用于小、中型容器、工具的消毒。方法是用纱布蘸酒精在容器、工具的表面涂抹即达到消毒目的。操作时应注意容器、工具的表面必须全部抹到,不能遗漏。如果容器水洗后还未干燥即进行消毒,则酒精的浓度应提高,可用90%-95%浓度的酒精,以防容器表面的酒精浓度被水分冲淡而降低杀菌能力。酒精涂抹后五分钟,用消毒水冲洗两次即可。使用酒精消毒,简单方便,效果好。酒精是一种较理想的消毒药品。

  (3)高锰酸钾(KMnO4): 高锰酸钾又叫灰锰氧,为紫色针状结晶。可溶于水,是一种强氧化剂,能使蛋白质变性,杀菌能力很强。消毒时按5*10-6的比例配成高锰酸钾溶液。把洗涤清洁的容器、工具放在溶液中浸泡5分钟,取出用消毒水冲洗两三次即成。白瓷砖池、水泥培养池的消毒,可用高锰酸钾溶液由池壁淋洒几遍,并泼洒池底,10分钟后再用消毒水冲洗干净。注意用高锰酸钾浸泡的时间不能过长,如果超过1小时,容器、工具上常有棕褐色沉淀附着,很难洗去。

  (4)石炭酸:其主要破坏生长细胞膜,使蛋白质变性。消毒时按3%-5%的比例配成溶液,把洗涤清洁的容器、工具在石炭酸溶液中浸泡半小时,再用消毒水冲洗两三次即成。

  (5)盐酸:取工业用盐酸1份加淡水9份配成10%的盐酸溶液,把清洗干净的容器、工具放入盐酸溶液中浸泡5分钟,再用消毒水冲洗2次即可。水泥池的消毒与使用高锰酸钾消毒方法相同。

  (二)培养液的制备

  微藻培养液(液体培养基)是在消毒海水中加入营养盐配制而成。

  1、海水的消毒

  为了防止敌害生物污染,配制培养液的海水必须经过消毒,杀死其中的敌害生物。 培养用水常用的消毒方法有过滤、加热、化学消毒剂和紫外线消毒等几种。选用消毒方法应考虑下列三方面的情况:第一,能够达到杀灭敌害生物的目的;第二,经消毒处理后的海水必须无毒,对培养藻类的生长、繁殖无不良影响或影响不大;第三,水消毒方法必须经济、简单、易行,并能够供应大量培养的需要。

  目前在微藻培养中常用的水消毒方法有以下几种:

  (1)加热消毒法:把经沉淀的或沉淀后再经砂滤的海水于烧瓶或铝锅中煮沸消毒。海水加热消毒,冷却后须经充分搅拌或震荡,使其恢复溶解气体量。通常保种培养用水多用加热消毒法进行消毒。

  (2)过滤除菌法:把经沉淀的海水,经砂过滤装置(砂滤池或砂滤罐)过滤,把大型的生物的非生物杂质除去,再经陶瓷过滤罐过滤,除去微小生物。还有双过滤装置,使海水经过两次过滤,除菌更有保证。砂滤装置,滤水迅速、滤水量大,在微藻的大量培养中使用,能满足大量用水的需要。但是微小生物不能完全隔除,除菌不彻底是砂滤的缺点。为了克服这一缺点,可采用两次砂滤、陶瓷过滤罐过滤或进行水的再消毒处理。

  (3)酸处理消毒:海水的PH值呈稳定碱性,长期生活于海水环境中的海洋生物对PH值变化的适应力和对酸性的耐力都较弱。根据这个原理,可使用酸处理方法消毒海水。海水经沉淀及砂过滤装置过滤后流入海水消毒池,用酸处理方法消毒。具体做法如下:

  酸碱溶液的配制: 1)量取浓盐酸84毫升,加蒸馏水(或用淡水代替)916毫升,配成一个摩尔浓度的盐酸溶液。 2)称取氢氧化钠40克,溶解于1000毫升蒸馏水(或用淡水代替)中,配成一个摩尔浓度的氢氧化钠溶液。

  酸处理:根据所需处理水量的多少,按每1000毫升海水加一个摩尔浓度的盐酸溶液3毫升的比例,加酸充分搅拌。加酸后海水的PH值可降到3左右(PH值2.9-3.1)。酸处理12小时以上,一般下午开始酸处理到次日上午止。处理完毕,再按每1000毫升海水加入一个摩尔浓度的氢氧化钠溶液3毫升的比例,加碱中和,使海水的PH值恢复到7.5-8.0左右。然后立即施肥,接种培养。

  (4)漂白粉或漂白液消毒:海水经沉淀及砂过滤装置过滤后流入海水消毒池,使用漂白粉或漂白液消毒。目前生产上最常用的是漂白粉[Ca(ClO)2] 和漂白液( NaClO)。漂白粉起消毒作用的成分是其中所含的有效氯。市面上出售的漂白粉,其有效氯含量一般为30%-35%,漂白精的有效氯含量一般为60%-70%,比漂白粉高一倍。

  但这种氯含量极不稳定,易与空气中的二氧化碳化合而不断消失,同时也容易从空气中吸收水分而潮解成半流动体,并很快分解产生次氯酸而散逸。如果产品出厂后经过的时间较长,储藏又不严密,就很容易失去消毒作用。因此在使用时,若不预先测定其有效氯含量,而仅以出厂时标明的氯含量来计算漂白粉使用量,往往达不到预期效果。

  消毒时,直接向水中加入漂白粉或漂白液,使有效氯含量达到25×10-6左右,停放6-7小时,可将水中的细菌、杂藻、原生动物等杀死。

  使用前,需要用硫代硫酸钠(Na2S2O3)进行中和。在生产上用硫酸——碘化钾——淀粉试剂作为指示剂,先计算出理论上所需硫代硫酸钠的量,将此数据作为参考,逐渐往里加,边加边搅动,加到一大半时,用指示剂测定,若变成蓝色,则说明还有余氯需要继续中和;当滴加指示剂无兰色出现时,说明中和彻底。有些生产单位用碘化钾溶液作为指示剂,若溶液变黄,则说明还有余氯需要中和,这种方法虽然在理论上成立,但容易在视觉上产生误差,造成水的中和不彻底,影响微藻的培养效果,不应提倡。

  关于消毒海水时漂白粉或漂白液的用量,可根据实际情况确定。用25×10-6有效氯的漂白粉或漂白液消毒海水,可以杀死大部分敌害生物,但对危害严重的大型变形虫无法杀灭。用100×10-6有效氯的高浓度漂白粉或漂白液消毒,可以杀死包括大型变形虫在内的一切敌害生物。敌害生物的出现具有季节性,一般以6-9月份为敌害生物危害严重季节,可以在些季节内用较高浓度的漂白粉或漂白液消毒海水。而在冬季和初春(敌害生物较少出现),可用较低浓度的漂白粉或漂白液消毒,力求降低生产成本。漂白粉消毒海水(或淡水)是生产上最常用的方法,成本较低,消毒也比较彻底。

  (5)紫外线消毒:紫外线消毒水的原理,系海水经一定量煞费苦心的照射产生臭氧,而臭氧产生的原子态氧具有较强的氧化作用,从而杀死海水中的部分微生物和某些藻类。

  这种消毒方法经济、残余的有害物质少。但设备较为昂贵,水流量不易控制,须有专人看管;否则,易烧坏紫外线灯管。有条件的单位可以考虑使用。

  砂滤海水以一定的流速经过紫外线消毒器,即可完成海水的消毒;或向消毒池海水充以经紫外线照射的空气,也可实现海水的消毒。

  (6)磁化水:磁化水是指以一定速度垂直流过适当磁场强度的水。用磁化水培养单胞藻,可以增加单胞藻对光和营养盐的吸收,加快单胞藻的生长速度,效果良好。青岛海洋大学用磁化水培养小新月菱形藻的试验结果表明,用磁化水培养60小时,平均密度可达到916万个/毫升,而肜非磁化水培养60小时,平均密度只有401万个/毫升。

  水产养殖上常使用人工制作的电磁场让水流通过,或专门制造的磁化水器,安装在进水口的周围,磁场强度在7000高斯以下。

  2、加营养盐(施肥)

  根据不同藻类选用不同的营养盐配方(参考微藻的培养部分)。[2]

  微藻 - 如何接种

  1、藻种质量

  藻种质量,对培养效果影响很大,一般要求选取生活力强,生长旺盛的藻种。藻种好坏的标准可从以下几个方面考虑:

  (1)外观:第一看颜色是否正常,正常情况下,绿藻类呈鲜绿色,硅藻类呈黄褐色,金藻类呈金褐色;第二看水中分布情况,有运动能力的种类上浮活泼运动;无运动能力的种类均匀悬浮于水中;第三看附壁和沉淀情况,好的藻种无明显附壁,无大量沉淀。

  (2)镜检:好的藻种细胞颜色鲜艳,运动种类运动活泼,无杂藻和敌害生物存在。

  2、接种比例

  选好藻种后,进行细胞计数确定投入量。用量可用以下公式计算:

  N2V2=N1V1

  其中:N1为藻种细胞密度;

  V1为藻种用量;

  N2为接种后培养液的藻种密度;

  V2为接种后培养液的体积。

  微藻接种一般采用(1:2)-(1:5)的比例,大量生产特别是室外培养应适当提高比例,常采用(1:1)-(1:3)比例接种。亚心形扁藻的藻种密度要达到30-40万细胞/毫升;三角褐指藻和新月菱形藻的藻种密度,要达到300万细胞/毫升;球等鞭金藻的藻种密度,要达到250万细胞/毫升。

  接种的比例大,可使培养液中的藻类一开始就占据优势,利用生物间的拮抗作用对其他可能污染的生物起抑制作用。另一方面又缩短了培养周期,这是培养成功的重要经验之一。特别是在环境因子不很适合,藻类生长不良,敌害生物有大量出现的可能时,高比例的接种量尤其重要。

  由于接种比例高,需要的藻种量大,藻种不足时,可以采用分次加培养液的方法。例如:一个20立方米水容量的培养池,如果一次按1:1的高比例接种,需要藻种10立方米,而采取两次加培养液的方法,只要藻种5立方米就可以了。第一次先配培养液5立方米,接种5立方米藻种,总水量为10立方米,为培养池容量的一半。培养两三天后,再加培养液10立方米,再培养三四天达收获密度。这样始终保持了1:1的高比例接种量。另一方面,分次加培养液,对藻类的细胞生长繁殖效果很好。

  3、接种时间

  接种时间最好选择上午8-10点时进行,而不宜在晚上接种。因为晚上不少藻类细胞沉在底部,而白天藻类细胞进行光合作用,有趋光上浮的习性,特别是具有运动能力的种类更明显。早上8-10点一般是藻类细胞吸出做藻种,弃去底部沉淀的藻类细胞(这些藻类细胞的生活力往往较弱),起到选种的作用。

  微藻 - 培养的工艺程序

  一般生产上采用一次性培养和循环生产法。一次性培养,就是一次性施肥、接种培养,最后达到收获。在生产池中加入消毒海水和营养盐,接入适量的藻种后,在适宜的条件下,4-5天即可达到最高细胞密度。此时池内的藻液可作为饵料输入育苗池。然后将池子清洗后再进行新的培养。如果以5天为一个培养周期,则可将生产池分为五组,每天接种一组,连续五天将所有生产池接满,然后循环地按次序进行收获。

  培养程序是:3000毫升三角烧瓶——20升细口玻璃瓶——保种池——生产池——育苗池。

  接种用量是:一只3000毫升三角烧瓶接种1只20升细口玻璃瓶,三只细口玻璃瓶接种一个1吨级的保种池,一个1吨级的保种池可接种两个5吨级的生产池。

  微藻 - 如何培养管理

  1、日常管理操作

  (1)搅动和充气:其作用表现在三个方面。第一,增加水和空气的接触面,使空气中更多的二氧化碳溶解到水中,补充由于藻类细胞的光合作用对二氧化碳的消耗;第二,防止水表面产生菌膜;第三,使藻类细胞均匀受光,使藻类细胞均匀分布,帮助沉淀的藻类细胞上浮而获得光照。

  在培养中可根据具体情况分别采用摇动、搅动和充气的方法。小型培养采用摇动培养瓶的方法;大口玻璃缸开放式培养采用棒形工具搅动的方法;塑料薄膜袋封闭式培养、玻璃钢桶以及水泥池开放式培养采用充气方法。摇动的搅动每天至少进行三次,定时进行,每次半分钟左右。充气一般通入空气,用罗茨鼓风机、小型充气泵或无油的气体压缩机。充气时要对空气进行过滤,使气体先通过空气过滤器,然后再通入藻类培养液中。

  (2)调节光照:光照适合与否,对藻类的生长关系很大。常用的是太阳光和灯光,要根据不同藻类对光照的具体要求来进行调节。但一般地讲,所有的藻类都不能忍受强烈的直射阳光。一般饵料培养室的顶部都用玻璃钢瓦采光,中午自然光比较强时,可用白布进行遮光;自然光较弱时,需增加人工光源。常用的人工光源有日光灯、碘钨灯、生物效应灯等。

  (3)控温;每一种藻类都有其适应温度范围和最适温度范围。如果能在控制温度的条件下培养,当然是最理想的。在目前还不具备控温条件的情况下,在培养过程中也应该尽可能使温度适合于培养藻类的要求。一般高温对培养藻类生长不利,在夏季室内培养时,须把门窗打开通风降温,必要时需增加换气扇或风扇等设备。如果气温急降,须关闭门窗,防止温差过大。在北方春季、冬季,气温较低,一般室外培养不能进行,在室内需要采取措施提高室温,才能进行正常培养,可采取水暖、气暖等措施。

  (4)其他管理:防止雨水及泥土的进入和防止蚊子幼虫和其他昆虫的滋生等。

  2、藻类生长情况的观察和检查

  藻类培养情况的好坏是培养成败的标准。因此,加强藻类生长情况的观察和检查十分重要。在日常管理工作中,每天上、下午必须定时各作一次全面观察,必要时配合显微镜检查,了解并掌握藻类的生长情况。

  藻类生长情况,可以通过培养液呈现的颜色,藻类细胞运动情况,是否有沉淀、附壁现象,菌膜及敌害生物污染迹象的有无等几个方面进行观察了解大体情况。

  肉眼检查比较直观,可以观察下列内容:

  (1)颜色:颜色的观察很重要,绿藻类的生长发育良好时,随着密度的增加,培养液由嫩绿到深绿色。三角褐指藻、新月菱形藻正常生长时藻液呈现褐色。藻体悬浮于水中呈云雾状水团,随着密度的增加,由浅褐色到深褐色。球等鞭金藻生长良好时呈金褐色。

  接种后,各种藻类的细胞浓度逐渐增加,正常情况颜色由浅变深。若颜色由深变浅则可能是由于环境因子不适宜(如肥料不足、光线过强、温度过高等)引起的;若出现其他的颜色,如蓝色、黄色、乳白色等,说明被别的藻类污染。

  (2)运动和沉淀:具有运动能力的藻类,在水中有一定的分布特点。当环境不适(如光线不足)时便下沉形成沉淀。当环境变好(如光线变强)时则上浮,上浮的藻类细胞比例越大越好。如果在天气正常时,藻类细胞白天也不上浮以及出现大量沉淀且经搅拌后又很快下沉,则属不正常现象。培养时间较长时,底部可有少量沉淀,这是正常现象。

  三角褐指藻、新月菱形藻没有鞭毛,但有管状的壳缝,由于细胞质能在管状壳缝内流动和外界水相磨擦,故藻体能作缓慢运动,生长良好时,悬浮在水中,形成趋光带。沉淀藻体的颜色如果保持原色,说明还没有死亡,有可能恢复其正常生长。如果沉淀藻体变成灰白颜色,表明已死亡、腐败。如果底部沉淀出现团块状或条状空白区,是由于敌害生物吞食的结果。

  造成藻类沉淀的原因是多方面的,最主要的是环境不良或营养不足使生长受到抑制而产生沉淀。许多藻类能形成保护性形态。如金藻类形成的胶群体,它们也能产生沉淀,但可渡过不良环境。敌害生物代谢产物的毒害也是引起沉淀的原因。此外,当细菌大量繁殖时,藻类细胞可由菌膜互相粘连而形成团块状,引起沉淀,这在扁藻培养中是常见的。

  (3)附壁:生长良好的微藻不附壁,产生附壁,说明环境不适,生长不好。

  (4)水面出现菌膜表明有真菌或细菌生长

  除了日常观察了解大体情况外,还必须配合显微镜检查,才能彻底掌握。因为藻类细胞及其敌害生物,个体都很小,只有借助显微镜考验观察清楚。对培养的藻类要经常镜检,特别是肉眼观察发现不正常时,利用镜检帮助确定导致不正常的原因是很有必要的。镜检主要有三方面的内容:第一,了解微藻的生长情况,主要是形成和运动情况;第二,检查鉴定敌害生物及杂藻,较大的敌害生物可用解剖镜镜检,小的敌害生物必须借助显微镜才能看到;第三,进行藻类细胞的计数,确定细胞浓度。藻类细胞浓度亦可用肉眼观察颜色的深浅来估计。

  3、出现问题的分析和处理

  通过日常的观察和显微镜检查,了解藻类生长情况,结合当时环境条件的变化进行分析,找出影响藻类生长的原因,采取相应的措施。影响藻类生长的原因很多,从内因看,藻种本身的质量是否优良;从外因看,任何一种环境条件的不适合,都会对藻类的生长产生不良影响。经常影响生长的因子主要是敌害生物、营养、温度和盐度几个因子。

  微藻 - 培养设施及设备

  (一)工作室

  在车间的一端,是饵料培养工作人员经常工作的地方,需配有显微镜、解剖镜及其他常用的仪器、工具、药品等。紧靠工作室还需有保种间和清洗消毒间。保种间面积视培养规模而定,一般为10-20平方米,配有空调、冰箱、具有人工光源的培养架等,工作人员在保种间可以进行藻种的分离、培养、保藏等工作。清洗消毒间,面积10-15平方米,室内设有清洗水池、消毒池、高压蒸气灭菌锅、炉灶等,可以供少量海水及容器、工具消毒用。

  (二)培养室

  培养室的作用是进行藻种和中继培养和投喂性大规模培养。培养室采用投光率80%左右的玻璃钢瓦覆顶,为进一步增加室内的光照强度,四周墙壁均开设大面积的玻璃窗。为调整光照强度,房顶部设有白布用作天幕,池水面上方1米处安装日光灯、碘钨灯或生物效应灯等人工光源;为防止高温季节培养饵料的高温问题,培养室对向各开设一个大型的换气扇或在培养池上方增设吊扇,进行通风降温;为防止雨期房顶漏雨和严寒季节室内蒸汽在房顶冷凝,可在房顶增设塑料薄膜。

  室内的主要设施有进行藻种中级培养的玻璃钢桶、小型的贴白瓷瓦的水泥池和大规模培养的大型水泥池。

  (三)沉淀池

  沉淀池一般建在地面以上,并经常建在较高地势处,兼作高位水池。若沉淀池建在地势较低处,则需要有二级提水设备。沉淀池容量为育苗池总容量的3-4倍左右,沉淀时间在48小时以上为好。沉淀池一般呈长方形或圆形,砖、石砌成,深度不宜过大,内层抹五层防水层。为达黑暗沉淀 ,池顶加盖。池底应有1%-3%的坡度,便于清刷排污。池下部设置排污口和供水口,顶部设有进水口和溢水口。为确保沉淀水的连续使用,沉淀池一般可分为2格以上。

  (四)培养容器

  在生产中常用的培养容器有下列几种:

  三角烧瓶:保种用100毫升的三角烧瓶。开始扩种时,培养容器逐步扩大,100毫升→250毫升→500毫升→3000毫升→5000毫升。三角烧瓶主要用于藻种的分离、保藏和藻种培养等小型培养方面。三角烧瓶可以煮沸消毒,也可以在烘箱中消毒。三角烧瓶的优点是瓶口小,不易落入孢子等,不易被污染。

  玻璃细口瓶:容量为10000或20000毫升,中继培养时用。

  玻璃钢桶:用环氧树脂加玻璃纤维布做成。中继培养时用。

  广口玻璃缸:一般商店用来装糖果、食品的玻璃缸,俗称糖果缸,因价格低,购买方便,南方多用来作为中继培养的容器。容量以8000-10000毫升为宜。玻璃质量以无色透明、无气泡为好。

  塑料薄膜袋:一般用透明薄膜制成,大小不等,中继培养及大量培养时使用。

  (五)水处理系统

  一个育苗场通常只有一套供水系统,同时提供饵料培养和育苗用水。微藻培养对水的要求比较严格,须经过过滤或化学药品处理,除去或杀死水中的敌害生物。因此必须配备水过滤装置和海水消毒池。

  1、水过滤装置

  海水从海区经动力管泵打到沉淀池,沉淀48小时后,经砂滤装置作第一次过滤,把大型的生物和非生物杂质除去,再经陶瓷过滤器过滤,将微小生物除去。常用的水过滤装置有:砂滤缸、砂滤罐、砂滤陶瓷过滤器等。

  (1)砂滤池:砂滤池的大小、规格各育苗场各不相同,但结构基本相同。砂滤池最底部设有排污孔,底上5厘米处设出水管,内为30厘米左右。

  高度的蓄水空间,其上由5厘米厚的水泥筛板或水泥条构架,作为填充料的支撑骨架。筛板上密布大小为3厘米左右的筛孔;筛板上面铺一层网目为1-2毫米的尼龙网,网上面铺大小为5厘米左右的碎石,碎石层厚5-8厘米。碎石层上面铺一层网目为1毫米的窗纱网,纱网上铺大小为1厘米左右、厚3-5厘米的石砾。再在石砾上铺以3-4毫米的粗砂,厚度为8-10厘米。粗砂层上铺两层60-80目的纱网,其上填充大小为0.2毫米、厚度达80厘米以上的细砂层。细砂层中由底至上插入几根直径为25-50毫米的灰塑料管,以释放整个砂层和蓄水空间的空气,保护砂层。细砂层上设置挡水板,缓冲水流对砂层的冲击、破坏。

  水砂滤的动力是靠自身的重力作用通过砂滤层过滤,过滤速度主要由砂滤池的面积决定。砂滤池的粗砂、石砾和碎石等仅起到对细砂层和海水的支撑作用,对海水真正起过滤作用的是细砂层。所以,细砂的粒度和质量及细砂层的厚度,直接决定砂滤海水的质量。一般地,铺装粒径0.2毫米、厚度为80厘米保护良好的石英质细砂层,理论上可滤除5微米以上的生物或非生物颗粒,但实际操作中,可滤除的最小颗粒一般为10微米左右。这样,砂滤池在使用过程中,表层细砂空隙非常容易被生物或非生物杂质堵塞,必须经常更换。否则影响滤水速度和滤水质量。

  现在部分育苗场用水经过两次砂滤,水经过一个砂滤池出来后,再进入另一个砂滤池过滤,效果较好。经过两次砂滤的水,用于大量培养藻类时几乎不用消毒。

  砂滤池的位置一般都紧靠沉淀池而又低于沉淀池,沉淀池中的海水由沉淀池的出水管又自流到海水消毒池,再由消毒池流入饵料培养池。这样,整个自流式水系统可很好地节约电力,一定程度地降低了育苗场的生产成本,在经济效益和社会效益双方面都有实际的意义。

  (2)砂滤罐:砂滤罐由钢板焊接或钢筋混凝土筑成,罐内由筛板向上依次铺设大小5厘米左右的碎石、2-3厘米石子、0.5-1.0厘米的小石子、2-3毫米和粗砂、1毫米的细砂、0.2毫米和粉砂。细砂层和粉砂层的厚度为30-50厘米左右,其余各野的厚度为3-5厘米。砂滤罐是封闭的,海水在较大的压力下过滤,单位面积的滤水速度较快。但由于砂滤罐的砂滤面积一般较小,所以总体速度较慢。原则上,可用反冲法清洗砂层而无须经常更换砂层,但生产上大多采用换砂层的方法去除表层的杂质。

  (3)陶瓷过滤器:砂滤装置因细砂间的空隙较大,只能除去较大的生物和杂质,一般10微米以下的微小生物较难滤除,不符合微藻培养用水的要求,必须用陶瓷过滤器进行二次过滤或用化学药品处理。

  根据用水量的不同,选用不同型号的过滤器。常用的有以下几种。陶瓷过滤罐是用硅藻土烧制而成的空心陶瓷过滤棒过滤的,能滤除原生动物和细菌,其工作压力为1-3千克/立方厘米,因此需要有10米以上的高位水槽向过滤罐供水,或用水泵供水。过滤罐使用一段时间水流不太通顺时,要拆开清洗,换上备用的过滤棒。把换下的过滤棒放在水中,用细砂纸把粘附在棒上的浮泥、杂质擦洗掉,用水冲净,晒干,供下次更换使用。使用陶瓷过滤器应注意防止滤棒破裂,安装不严,拆洗时棒及罐内部冲洗消毒不彻底造成的污染。装好后开始使用时排掉过滤水5分钟,然后才能做为微藻培养用水。在正常情况下,经陶瓷过滤罐二次过滤海水,符合微藻培养用水的要求,不必再用化学药品处理。

  2、海水消毒池

  在微藻的大量培养中,由于砂滤清除敌害生物不彻底(两次砂滤、陶瓷过滤除外),过滤海水需经化学药品再消毒处理。中等规模以上的生产单位,应该建造专用的海水消毒池。消毒池最好有两个,可以交替地进行海水消毒和供应每天培养用水。消毒池的大小应根据每天的最大用水量决定,一个消毒池应该能供应一天的用水。消毒池最好能建在室内,与饵料培养靠近,池顶有木盖盖紧,离池底6-8厘米处有管道直接通培养池。有条件的单位,消毒池最好高出饵料培养池池面30厘米。若与培养池在同一水平面上,则需要和水泵打水或用消毒过的桶舀水。无条件的单位,也可用饵料培养池代替海水消毒池。

  (六)饵料培养池

  其用于大规模生产培养。培养池建在室内或室外,为易于控制培养的环境条件多以室内建造为主。

  1、培养池的结构

  培养池采用水泥混凝土建造,表面涂以防水胶;池形取长方形;池深70厘米(水深50厘米左右),中池(2-4立方米左右)和大池(5-10立方米左右)。由于大池受光面积大、气体交换量大、单胞藻生长良好及节省占地面积等优点,很多厂家直接建造大池。为保证饵料的安全供应,饵料培养水体应为育苗水体的1/3以上;二者的比例如达1:1则最为理想。

  2、建培养池应注意的问题

  一般来说,排列成行的培养池,多取南北向,以避免受到太阳光长时间的照射。培养池位置可依各地具体地形而定。但必须注意以下几点:第一,培养池的池面最好低于海水消毒池30厘米左右,如果没有海水消毒池,则应低于砂滤池50厘米左右,只有具有一定的水位差,进水系统供水才能保持一定的压力和流速;第二,饵料培养池的位置要靠近虾、贝育苗室并高于育苗池50厘米左右,目的是为方便投饵或通过管道使饵料自流化;第三,培养室应设在地面平坦、四处无遮阴,阳光充足和通风好的地方;第四,培养池应高出地面,一方面使泥沙杂物不易吹入池中,容易保持清洁,另一方面操作方便。

  (七)充气系统

  1、充气机

  大量培养微藻时各地可根据具体情况选用罗茨鼓风机、空气压缩机或小型充气泵等设备产生气源,风机的匹配功率由水体的大小确定。为确保空气的清洁可以进气孔外增设空气过滤器。

  2、充气管和散气石

  供气管采用灰塑料硬管,池内充气管多采用塑料软管。散气石采用低标号的炭化硅胶气石(如80号)或末端不加散气石,以防止藻液表层形成过厚的有机物膜。

  微藻 - 其综合应用及前景

  医药工业

  天然β-胡萝卜素具有抑制肿瘤、抗辐射和升高白细胞等作用,尤其对萎缩性胃炎、口腔溃疡、皮肤疾病和放化疗患者有着明显的辅助治疗效果。已开发出的产品有天然胡萝卜素口服液、冲剂、口含片、水分散型干粉等产品。近些年对不饱和脂肪酸(DHA、RHA)在婴儿食品和保健品中的使用都深受人们的欢迎。微藻胶体(ECP)有较强的抗肿瘤活性引起国内外专家的关注。

  食品工业

  藻类的粗蛋白含量超过60%,生物学产量高于任何作物。藻类蛋白的生产正在迅速发展,小球藻、栅列藻、新月藻、螺旋藻己被用作蛋白质来源,小球藻、螺旋藻、杜氏盐藻还以粉剂、丸剂、提取物等形式投放保健品市场或用作食品添加剂。

  动物饲料

  微藻的蛋白质含量较高,所含核酸超过常规饲料和食品,人工培养用做浮游动物的饵料,成功地用在饲养鱼类或作动物性浮游生物(如红虫、牡蛎等)。

  环境检测

  微藻的生长状况能直接反映水质情况,判断空气中的毒性气体,打破常规气体样品的分析和检测,Naessens. M等人将小球藻固定在疏水膜上和膜电极相连制成生物反应器,反映空气甲醇蒸汽和四氯乙烯含量。Podola B等人改用调制荧光仪检测(PAM -2000)莱茵衣藻检测气体中的甲醇、甲醛 。

  环境净化的作用

  Chung P.废将水处理和单细胞蛋白(SCP)的生产结合,对沼气厌养发酵的猪粪废水进行处理,螺旋藻产量为5g /m2 /d。利用反应器挂膜技术可解决藻类和水的后续分离的问题。现在污水处理方法,大都依赖微生物的活动 ,处理后4种营养盐都达到国家排放标准。微藻生长脱氮除磷、难降解有机物、及Co、Mn、Hg等重金属离子。微藻还能吸收一定浓度NOx, SOx, H2S,在挪威、日本早已开始研究培养微藻进行环境保护。

  生物技术

  微藻生长周期短、耐受性的基因是生物技术关注的热点,开发新型的微藻-生物反应器,利用藻类蛋白生产口服疫苗等,用活性物质制成干粉,口服。王义琴等人将防御素基因转入椭圆小球藻细胞内,生产昂贵的防御素已取得一定的成果,但仍有一个巨大的未知藻类待人们去开发。

  可再生能源的制造

  藻中富含的酯类和甘油是制备液体燃料的良好原料;微藻热解制备的生物质燃油热值高,是木材或农作物秸秆的1.4~2倍。在世界能源消耗中,生物质能已占14%。将微生物和微藻混合培养,生产高纯度的乙醇、甲醇、丁烷等能源化合物,是理想的可再生能源。

  中国人口多,增长速度快,耕地面积以每年1.6%的比率递减,光和效率高于常规作物,微藻生产成本低、营养物质丰富、经济效益高、用途广泛的特点,使藻类在各领域的研究工作蓬勃发展,尤其在医药业,对人类的身体健康有着突出的贡献,可带来巨大的经济效益,是一个很有潜力的经济开发项目。

  微藻 - 相关新闻

  2011年启动的中国微藻能源方向的首个国家重点基础研究发展计划(973计划)项目“微藻能源规模化制备的科学基础”,2月19日在浙江省嘉兴市嘉兴科技城正式启动。项目由华东理工大学、中国海洋大学、中科院水生生物研究所和江西新大泽实业集团有限公司等单位联合组织实施。项目的依托部门是上海市科学技术委员会,依托单位是华东理工大学,华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室李元广教授为该项目首席科学家。

  目前,生产生物柴油所用原料均靠种植油料植物,棕榈树、麻风树、油菜等。由于油料植物的油脂面积产率不高,大力发展生物柴油必然要占用大量耕地,影响粮食生产。而微藻种类繁多、分布广、繁殖快,是最简单、最古老的低等植物,它可直接利用阳光、CO2及N/P等简单营养物质快速生长并在胞内合成大量油脂(主要是甘油三酯),为生物柴油生产提供新的油脂资源;同时可以利用我国广阔的盐碱荒地等非耕土地,孕育一条生物柴油开发的新途径。

  微藻能源虽然发展前景广阔、优势独特,已获国内外公认,但迄今为止世界各国在该领域的研发工作还停留在实验研究和中试论证的起步阶段,均遇到技术不成熟而导致成本高这一瓶颈,因而微藻能源在全球尚未实现规模化制备且基础研究薄弱。

  “微藻能源规模化制备的科学基础”项目,将以推动微藻能源规模化制备中核心技术的重大突破为目标,以能源微藻户外大规模培养的实际条件为背景,以提高微藻能源规模化制备系统中各单元的效率为主线,研究从藻种选育到微藻能源规模化制备系统构建过程中亟待解决的生物学及工程学方面的3个关键科学问题——“能源微藻胞内代谢及油脂合成与积累的系统生物学机制”“能源微藻规模化光自养培养的物质和能量转化及环境调控规律”和“微藻能源规模化加工及系统集成优化原理”。

  围绕上述问题,项目拟从胞内代谢认知、规模培养、能源产品加工与系统集成优化三个层面进行系统深入研究。第一个层面是以藻种选育及细胞本身基础代谢规律与调控机制发现为主要研究内容;第二个层面是从规模培养角度,研究微藻细胞对环境响应与调控机制、光生物反应器设计原理和放大规律、能源微藻光自养培养工艺优化及放大方法;第三个层面主要是从藻细胞采收、油脂提取、生物柴油制备、非油脂组分综合利用等能源微藻加工及培养与加工系统集成优化角度,挖掘提高效率的原理和方法。

  项目包括“能源微藻优良藻种(株)选育原理与综合评价体系”“能源微藻光合固碳和油脂积累的代谢网络及系统生物学研究”“基于光照方向混合及光衰减特性的光生物反应器设计与放大原理”“能源微藻规模化光自养培养过程的环境响应、优化及放大原理”“能源微藻采收、油脂提取及生物柴油制备原理与方法”和“非油脂组分资源化利用优化及微藻能源规模化系统集成”6个课题。

  项目预期于2015年实现微藻能源规模化制备中的关键科学问题的重大突破,为产业化技术瓶颈的突破提供创新源泉。[3]

  微藻 - 最新研究动态

  实验:微藻产油解决能源大问题

  李元广教授是清华大学博士,他的科研生涯和藻类结缘。 1995年,他开始研究藻类培养。 “那时,微藻能源技术还没有兴起,我们培养藻类,是为了做营养品和饲料。 ”据介绍,微藻是一种低等植物,在陆地、海洋分布广泛,种类繁多,造成湖泊污染的蓝绿藻就是微藻大家族的成员。微藻光合作用效率非常高,可直接利用阳光、二氧化碳和氮磷等简单营养物质快速生长,合成油脂、蛋白、多糖、色素等物质。上世纪90年代,李元广研究藻类培养,就是为了提取微藻中的蛋白、多糖、色素等高附加值物质,把它们转化为营养品和高档饲料的原料。

  “当时,我们没有去提取微藻中的大量油脂,是因为柴油价格便宜,而用微藻制生物柴油的成本太高。”李元广教授告诉记者。随着石油等能源的日益稀缺,以及“应对气候变暖”和发展低碳经济成为全球的共识,微藻制油变成能源科研领域的热点问题。2006年,美国再次兴起微藻能源的技术研究,日本和欧洲科学界、我国科学界也积极跟进。李元广教授就是从那时起带领团队投入研究,试图用小小的微藻来应对能源和二氧化碳减排的大问题。

  优势:节约耕地减少二氧化碳排放

  据介绍,目前,生产生物柴油所用的原料均靠种植油料植物,如棕榈树、麻风树、油菜等。由于油料植物的油脂面积产率不高,大力发展生物柴油必然要占用大量耕地,影响粮食生产。微藻制油不需要占用大量耕地,只要有水资源和阳光的地方就行。开发 “微藻油田”,可选择海边和有水资源的盐碱地,在这些地方大面积培养微藻,让它们通过光合作用生产油脂。当微藻的细胞中积累大量油脂后,技术人员就会将其采收,并将油脂提取出来。因此,微藻能源不但产油量高,还能缓解生物能源发展中 “与人争粮、争地和争水”的矛盾。

  另一方面,微藻制油能大量减少二氧化碳排放。据计算,每培养1吨微藻,就需要消耗约2吨二氧化碳。

  李元广教授表示,目前我国柴油的年消耗量为上亿吨,如果全部用 “微藻油田”提供,约需要几亿吨微藻,在培养微藻过程中就能消耗掉近10亿吨二氧化碳。 “我国目前每年的二氧化碳排放量在 70亿吨左右,微藻制油能减排1/7左右,这个减排量相当可观。”微藻能源技术成熟后,可将 “微藻油田”建在热电厂、化工厂等二氧化碳排放量很高的工厂旁,解决二氧化碳的点源排放问题。微藻在生长过程中还需要大量氮和磷,这正是造成湖泊、河水富营养化污染的“元凶”, “微藻油田”还能用于净化工厂排放的废水和城市生活污水。

  进展:联合攻关突破高成本瓶颈

  微藻能源虽然发展前景广阔、优势独特,但迄今为止,世界各国在该领域的研发工作还停留在实验研究和中试论证起步阶段,技术尚不成熟,遭遇成本过高这一瓶颈。

  为了攻克这些技术难题,突破瓶颈,中国启动了名为“微藻能源规模化制备的科学基础”的 “973”项目。该项目由华东理工大学、中国海洋大学、南京工业大学、北京化工大学、中科院海洋研究所、中国石油大学(北京)等十几家单位联合组织实施。

  作为该项目的首席科学家,李元广教授充满了信心。他说,“973”项目将以推动微藻能源规模化制备中核心技术的重大突破为目标,以能源微藻户外大规模培养的实际条件为背景,研究从藻种选育到微藻能源规模化制备系统构建过程中亟待解决的生物学及工程学方面的三个关键科学问题——“能源微藻胞内代谢及油脂合成与积累的系统生物学机制”、“能源微藻规模化光自养培养的物质和能量转化及环境调控规律”和“微藻能源规模化加工及系统集成优化原理”。

  李元广表示,在5年时间内,项目团队将开发出一个“微藻资源库”,有望提供适合在我国不同地方、不同气候条件下生长的藻株。今后,各省市在建设“微藻油田”时,就可在资源库中挑选合适的微藻品种。项目团队会深入研究微藻产油的机理,力争提高微藻产油的效率,降低它的成本。项目团队还会建立一套中试系统,全面评估微藻制油的技术指标、经济指标和环境指标,为中国节能减排和能源开发做出贡献,有利推动我国微藻能源的产业化进程。


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